siRNA轉(zhuǎn)染

更新時(shí)間：2022-05-07

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siRNA轉(zhuǎn)染

1. siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法

siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法有化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)等。技術(shù)的選擇要考慮轉(zhuǎn)入時(shí)細(xì)胞的承受能力、細(xì)胞對(duì)病毒感染的敏感性、細(xì)胞生長(zhǎng)特性等實(shí)驗(yàn)條件的限制。對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)講化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)比較合適，而對(duì)于懸浮細(xì)胞，電穿孔更有效。

2. 轉(zhuǎn)染試劑的選擇

在選擇轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，首先考慮的是特定的細(xì)胞株，而不是被導(dǎo)入細(xì)胞中的物質(zhì)。在試劑的選擇上建議選擇線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑。

3. 篩選轉(zhuǎn)染試劑

好的轉(zhuǎn)染試劑有以下特點(diǎn)：如下表

特性	程度	實(shí)例
毒性	小	對(duì)細(xì)胞的毒性小。
轉(zhuǎn)染率	高	在siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中有較高成功率
導(dǎo)入效果	準(zhǔn)確	在mRNA水平檢測(cè)siRNA導(dǎo)入的效果比用看家基因的siRNA陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)更準(zhǔn)確。

4. 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中死亡的處理方法

如果細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后大多數(shù)死亡，那就說(shuō)明轉(zhuǎn)染條件不適合細(xì)胞生存，需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時(shí)需要考慮的因素：轉(zhuǎn)染試劑（線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑）和細(xì)胞特異性條件。例如：siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞傳代數(shù)和細(xì)胞密度等。

5. 提高難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法以及轉(zhuǎn)染效率的確定

如何提高難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是目前研究的一個(gè)技術(shù)難題。一般推薦使用電轉(zhuǎn)移法，該方法對(duì)細(xì)胞的損傷比較大，所以這種方法不太合適。熒光標(biāo)記siRNA是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)常用的檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的方法。

6. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡的原因及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

死亡原因	解決策略	如何優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件：包括轉(zhuǎn)染前調(diào)整細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染濃度、檢測(cè)時(shí)間等。
脂質(zhì)體毒性	優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件
轉(zhuǎn)染濃度過(guò)高
轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞狀態(tài)不佳

選擇像線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑這種毒性小的轉(zhuǎn)染試劑也可以達(dá)到優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的目的。另外，如果siRNA靶向的基因?qū)S持細(xì)胞生長(zhǎng)非常重要，那么細(xì)胞死亡的現(xiàn)象可能是由基因干擾。如果檢測(cè)受到細(xì)胞死亡的影響，可以適當(dāng)調(diào)整檢測(cè)時(shí)間。